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安捷伦实用攻略 ,如何选择 C18 色谱柱?

安捷伦实用攻略 | 方法开发时,如何选择 C18 色谱柱?

在色谱方法开发过程中,分离度、柱效、峰形是考察色谱柱选择性是否合适的主要性能指标。

方法开发中的分离度

根据分离度(Rs)公式,分离度的影响因素主要有柱效(N)、选择性(α)和保留因子(或称容量因子,k):

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公式1作为分离度改善的理论基础。通常,方法开发过程中,通过提高化合物保留 (k)、提高柱效 (N)、以及提升选择性 (α) 来达到分离度的改善。

选择性因子(α):

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式中 k1 和 k2 分别是第一个峰和第二个峰的保留因子。

根据公式 1 和公式 2,当选择性因子提高 0.1 时,对分离度的贡献是 Rs 大约为原来的 1.8 倍。因此选择性的改变对分离度的改善效果显著,如图 1 所示。

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图 1. 分离度与柱效、选择性、保留因子的关系

与选择性有关的因素:

固定相:选择不同化学修饰的键合相(不同的 C18 柱或其它键合类型色谱柱)

流动相:调整有机相的类型、pH 值、盐浓度、两相比例等

柱温

方法开发中的色谱柱选择

在色谱固定相的选择和使用中,最常用的键合相类型是十八烷基硅烷键合硅胶(C18)。不过,由于固定相物理特性与化学修饰的差异,使得不同的 C18 选择性不尽相同。选择色谱柱时,如果一种类型的 C18 柱分离度不足,就可以选择与之选择性差异较大的 C18 柱来进行优化。

以 Agilent InfinityLab Poroshell 系列中的 C18 液相色谱柱为例:

Poroshell 120 EC-C18 为封端的碳十八固定相,对酸性、碱性、中性化合物都有良好的选择性,已经成为方法开发的首选,也是在 Agilent 1260 Infinity II 四元泵液相色谱系统中标配的色谱柱。

 

与 EC-C18 柱不同,Poroshell 120 SB-C18 柱却是不封端的碳十八固定相。由于裸漏的硅醇基存在,可与待分离物发生氢键、离子间作用等,因此 SB-C18 的选择性与封端的 C18 柱存在显著差异。可以利用这个特点,在方法开发时 SB-C18 和 EC-C18 通常可以作为方法开发的起始色谱柱。另外,SB 的全称是 StableBond,顾名思义意为“稳定的键合相”,这里说的稳定,主要是在C18硅烷长链的两侧采用异丁基进行立体的保护,使得 SB-C18 在低 pH 下有较好的耐受性能。

同样采用 Poroshell 120 的硅胶,HPH-C18 与 EC-C18 和 SB-C18 又有所不同。在进行键合之前,在 Poroshell 硅胶的表面多孔层,先进行了有机杂化处理,再进行 C18 键合和封端修饰,得到的 HPH-C18 色谱柱具有了高 pH 耐受的特点。

因此,表面化学结构的差异,三种常用的 Poroshell C18 柱,在选择性上具有显著区别。表 1 列出了以 EC-C18 为基准,HPH-C18 与 SB-C18 的相似度因子 Fs。当 Fs 因子大于 3.0 时,固定相选择性存在差异。

表 1. 三种固定相选择性差异比较(以 EC-C18 为基准)

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问渠哪得清如许,为有源头活水来,新产品 Poroshell CS-C18 上市!

Poroshell 色谱系列在色谱分析行业已经得到了广泛的认可,安捷伦也一直在拓展 Poroshell 系列色谱柱的产品线。

2020 年 11 月,安捷伦推出了新产品 Poroshell CS-C18 柱,进一步拓展了 C18 固定相的类型。该固定相是在 Poroshell 实心核颗粒的表面多孔层在进行高 pH 耐受的杂化处理之后,再进行 C18 键合、封端和正电荷修饰,其中使用的键合相还进行了侧立基的保护。这样 CS-C18 固定相的表面,不仅具有 C18 提供的疏水作用、而且还具有正电荷的离子作用,选择性也与其它的 C18 键合相有显著差异。同时,硅烷链侧立基保护、多孔硅胶表面杂化处理,使得固定相pH耐受范围得到了拓宽。

在 Poroshell C18 的四种 C18 键合相中,涵盖了 RPLC 模式下的主要作用力,选择性彼此之间有显著差异,见图 2。利用这些固定相的选择性差异,可以方便地进行方法开发中的色谱柱选择。

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图 2. Poroshell 的 4 种 C18 固定相

应用实例

碱性条件下选择性差异

在 pH=10 的体系下,耐碱的 CS-C18 与 HPH-C18 选择性存在显著差异。

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图 3. 农药组分在碱性体系下 LC-MSMS 色谱图结果比较

酸性条件下选择性差异

在酸性体系下,不同 Poroshell C18 柱的保留、分离度有显著差异。

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图 4. 阿片类药物在酸性体系下 HPLC 分析色谱图比较

峰形及载样量比较

在酸性体系下,在碱性药物阿米替林的杂质分析时,采用 CS-C18 与传统封端的 C18 柱进行比较,CS-C18 柱对碱性组分具有更好的峰形、载样量和分离度。

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图 5. 不同色谱柱对阿米替林及杂质(0.25%)不同进样量分析结果比较

酸性体系下 LC/MS 灵敏度比较

在甲酸体系下,在进行液质联用分析时,CS-C18 柱提供可更好的灵敏度、响应和峰形。

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图 6. 甲酸体系中低浓度标样(50ng/ml) 在 LC/MS/MS 中灵敏度比较

 

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